合成所戴俊彪：染色体编码的T4SS独立地促进粪肠球菌的水平基因转移 | Cell Press青促会评述

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作为世界领先的全科学领域学术出版社，细胞出版社特与“中国科学院青年创新促进会”合作开设“青促会述评”专栏，以期增进学术互动，促进国际交流。

2022年第三十七期（总第122期）专栏文章，由中国科学院深圳合成生物学研究所研究员、副所长戴俊彪，就Cell Reports中的论文发表述评。

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粪肠球菌（Enterococcus faecalis，E. faecalis）是导致非细菌性血症的主要原因之一，引起包括尿路和血液在内的各种组织感染。多重耐药（MDR）粪肠球菌的出现和流行，特别是耐万古霉素的粪肠球菌，已经对临床治疗提出了挑战并导致病例死亡率不断上升。此外，由于基因组中存在丰富的移动元件，粪肠球菌已经成为MDR基因传播的基因库。为了控制MDR基因传播的风险，迫切需要研究粪肠球菌分离株之间的水平基因转移（HGT）机制，并探索在临床中限制HGT的有效策略。IV型分泌系统（T4SS）可形成易位通道，介导DNA和蛋白质底物转移到细菌，促进MDR细菌的进化和出现。在革兰氏阴性菌中，T4SS由质粒编码（PE-T4SS），并根据T4SS的亚基组成、结构以及分子功能的不同可以分为F-型与P-型两大类。与革兰氏阴性菌相比，革兰氏阳性细菌中的T4SS研究尚处于起步阶段。尽管T4SS促成革兰氏阳性细菌的极端生物多样性和MDR病原体的产生已经成为广大研究人员的共识。然而，革兰氏阳性细菌中T4SS的详细功能仍有待进一步的研究。

首都医科大学陈晨研究团队在本研究中首次报道了粪肠球菌中染色体编码的T4SS（CE-T4SS），CE-T4SS能够以不精确的方式介导基因组范围内的基因转移，并证明CE-T4SS与PE-T4SS是相互独立的系统。研究人员首先通过接合转移实验，证明MDR E. faecalis V583可以将红霉素抗性基因erm转移至其他粪肠球菌中，并通过基因组分析发现CE-T4SS广泛分布于粪肠球菌中。随后通过在CE-T4SS中插入抗性基因erm并计算其接合转移的效率证明CE-T4SS中的virB4与virB6是CE-T4SS调节粪肠球菌HGT所必需的基因。单核苷酸多态性（SNP）分析表明，不同接合菌的基因组整合/剪切位点存在明显的差异。为确定CE-T4SS染色体整合的功能边界，研究人员通过在50 kb CE-T4SS基因岛的不同位置插入抗性基因erm，设计了9个D5165突变体（S2-S10）以及CE-T4SS基因岛上下游的另外两个突变体（S1和S11）。突变体接合转移验证发现，DNA片段越靠近CE-T4SS，接合转移效率越高（图1）。为评估CE-T4SS的DNA转移能力，研究人员进一步将抗性基因erm插入全基因组的12个随机位点，随后进行接合转移验证，结果表明CE-T4SS可调控粪肠球菌全基因组范围的基因转移。为进一步研究DNA转移的过程，研究人员首先鉴定了CE-T4SS的复制起点（c-oriT）。随后，以粪肠球菌WT205为出发菌株，通过对T4SS与oriT的交叉突变来证明CE-T4SS的系统独立性。具体包括以下几步：第一步将抗性基因erm插入质粒上，获得对照菌株（DP1）。第二步删除WT205中PE-T4SS，菌株随即丧失基因转移功能(DP2)。第三步将c-oriT插入至质粒上，部分恢复其基因转移能力（DP3），从而表明CE-T4SS可以识别质粒上的c-oriT。接下来，删除质粒上的p-oriT获得丧失基因转移能力的突变菌株（DP4）。然后将c-oriT插入质粒获得部分恢复其基因转移能力的突变菌株（DP5）。从而证明探究CE-T4SS只能识别c-oriT。反之，将erm抗性基因插入基因组上的T4SS与oriT，同样证明了CE-T4SS只能调控c-oriT相关的DNA片段（图2）。本研究发现的CE-T4SS是革兰氏阳性细菌中T4SS的一个重要认识。此外，随机、大片段的非位点特异性HGT和独立于PE-T4SS的基因转移模式很可能是粪肠球菌具有非常大的遗传变异性的潜在机制。上述工作于11月8号发表在Cell Press旗下期刊Cell Reports上。

▲图1 CE-T4SS染色体DNA在基因组岛内的转移方式和转移效率

(A) 对两个随机选择的接合子（C5165T1[TC1]和C5165T2[TC2]）、受体和供体菌株进行全基因组测序，发现接合子的基因组含有不同的整合DNA片段。

(B）根据转移DNA片段的不同，选择了11个位点作为erm基因插入的位置。基因组岛中的S2至S10，以及基因组岛两侧的S1和S11。

(C）为了评估CE-T4SS基因组上其他位置转移DNA的能力，选择了12个基因组位点作为erm基因插入的位置。D5165染色体的G1至G12。所有的接合转移实验都重复了3次。

▲图2 CE-T4SS是一个独立于PE-T4SS的纳米机器。

(A）四个存在于CE-T4SS基因组内的oriT位点；分别敲除oriT1-oriT4来确定每个位点在CE-T4SS转移中的作用。c-oriT和p-oriT的序列不同，但c-oriT和p-oriT都是典型的具有反向重复序列的oriT结构。

(B）构建DP1作为阳性对照来检测pCF10的转移。DP2和DP4是分别删除了PE-T4SS与p-oriT构建的，作为阴性对照。DP3和DP5是在PE-T4SS基础上构建的，删除了p-oriT，插入了c-oriT。

(C）构建DC1作为阳性对照来检测CE-T4SS的转移。DC2和DC4是在CE-T4SS的基础上构建的，删除了c-oriT，作为阴性对照。DC3和DC5是在CE-T4SS的基础上构建的，但分别删除了c-oriT和插入了p-oriT。所有的接合转移实验都重复了3次。

论文摘要

细菌IV型分泌系统（T4SS）是通过水平基因转移（HGT）介导抗生素抗性基因传播的特定装置。随着可转移的质粒编码（PE）-T4SS的深入研究，多重耐药粪肠球菌（E. faecalis）代表了一种临床公共卫生威胁。在本文中，我们报道了一种染色体编码（CE）-T4SS，存在于40%的粪肠杆菌分离株中。与PE-T4SS相比，CE-T4SS在蛋白质结构上表现出明显的特征，能够以不精确的方式介导大片段、基因组范围内的基因转移。相互交换CE-T4SS-或PE-T4SS相关的复制起点（oriT）会破坏HGT功能，从而表明，与PE-T4SS相比，CE-T4SS是一个独立的系统。综上所述，CE-T4SS丰富了革兰氏阳性细菌中HGT的认知，并引发我们探索粪肠杆菌的更多进化机制。

Bacterial type IV secretion systems (T4SSs) are the specific devices that mediate the dissemination of antibiotic resistant genes via horizontal gene transfer (HGT). Multi-drug-resistant Enterococcus faecalis (E. faecalis) represents a clinical public health threat because of its transferable plasmid with a well-characterized plasmid-encoded (PE)-T4SS. Here, we report a chromosome-encoded (CE)-T4SS that exists in 40% of E. faecalis isolates. Compared with the PE-T4SS, CE-T4SS displays distinct characteristics in protein architecture and is capable of mediating large and genome-wide gene transfer in an imprecise manner. Reciprocal exchange of CE-T4SS- or PE-T4SS-associated origin of transfer (oriT) could disrupt HGT function,

indicating that CE-T4SS is an independent system compared with PE-T4SS. Taken together, the CE-T4SS sheds light on the knowledge of HGT in gram-positive bacteria and triggers us to explore more evolutionary mechanisms in E. faecalis.

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述评人简介

戴俊彪

中科院深圳先进院合成所副所长

广东省合成基因组学重点实验室主任

深圳市合成基因组学重点实验室主任

[e-mail]

戴俊彪，研究员，博士生导师，中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所副所长，广东省合成基因组学重点实验室及深圳合成基因组学重点实验室主任。实验室的主要研究方向是利用不同的模式生物进行合成生物学研究，专注于开发基因合成、组装和合成基因组学新技术。在过去的五年中，作为通讯作者在包括《科学》在内的权威杂志上发表了50多篇论文，并入选2017年中国十大科学进展。他是国际酿酒酵母基因组合成计划 （Sc2.0）和基因组编写计划（GP-write）的主要成员，目前正在领导 "GP-write中国"。2017年被授予国家科学基金杰出青年学者称号。

Professor Junbiao Dai is currently the deputy director of iSynBio, Shenzhen Institutes of Advanced Sciences (SIAT), Chinese Academy of Sciences (CAS). He is the director of Guangdong Provincial Key Laboratory of Synthetic Genomics and Shenzhen Key Laboratory of Synthetic Genomics. Dr. Dai’s research interests lie in synthetic biology using different model organisms, focusing on development of new technologies for genes synthesis, assembly and synthetic genomics. He’s one of the key members in synthetic yeast consortium (Sc2.0), Genome Project-write (GP-write) and has finished the synthesis of the largest yeast chromosome XII. Dr. Dai have published many peer-reviewed articles in prestigious journals such as Cell, Nature and Science. He is the winner of Albert Lehninger Research Award from Johns Hopkins University, Newton Advanced Fellowship and C.C. Tan Life Science Innovation Award. In 2017, He was awarded the National Science Fund for Distinguished Young Scholars.

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相关论文信息

原文刊载于CellPress细胞出版社

旗下期刊Cell Reports上，

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Youth Innovation Promotion Association (YIPA) was founded in 2011 by the Chinese Academy of Science (CAS). It aims to provide support for excellent young scientists by promoting their academic vision and interdisciplinary research. YIPA has currently more than 4000 members from 109 institutions and across multiple disciplines, including Life Sciences, Earth Science, Chemistry& Material, Mathematics & Physics, and Engineering. They are organized in 6 discipline branches and 13 local branches.

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